同花顺-圈子

　　泛生子依托核心荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）及高通量测序等平台提供分子诊断整体解决方案。“泛谈-分子诊断”专栏旨在与每一位致力于分子诊断应用发展的伙伴共同梳理技术发展脉络、探讨临床转化应用、推动检验发展，为更多病患提供精准诊疗方案。

　　近期主题我们将继续梳理分子诊断技术，主要围绕基因测序方向，逐一介绍测序技术&测序仪的发展、原理及操作等。今天我们讨论第三代测序技术—SMRT测序。

　　PacBio平台的SMRT（single molecule real time sequencing,SMRT）测序区别于高通量测序技术，是单分子实时荧光测序技术，实验操作主要有3个步骤：DNA文库制备—测序—结果判读。

　　图1 SMRT测序原理示意图[1]

　　SMRT测序技术原理及过程

　　DNA文库制备

　　基因组DNA经过片段化、末端修复后，将发夹式接头连接到双链DNA分子两端，形成一个封闭的圆圈。再将引物和聚合酶退火到接头上，无需PCR过程即可形成哑铃状的待测序文库。

　　图2 待测序文库复合物示意图[2]

　　绿色：发夹接头；黄色和紫色：双链DNA分子；灰色：聚合酶；橙色：引物

　　测序

　　1. SMRT Cell芯片

　　SMRT测序反应发生在SMRT Cell芯片上，芯片上排列着15万-800万个直径为几十纳米的测序微孔—ZMW（Zero-Mode Waveguide，零模波导）孔。由于ZMW孔直径很小，激发光从底部向上照射后，在小孔内的穿透能力会逐渐衰减，不能穿透小孔，因此能量被限制在小孔内。

　　图3 单个SMRT Cell芯片[2]

　　2. 测序反应

　　将待测序文库加入芯片后，文库随机进入ZMW孔中，单个文库进入单个小孔的概率符合泊松分布原理。文库上的聚合酶被固定在ZMW底部的玻璃板上，溶液中充满许多游离的4种带不同颜色荧光基团的dNTP，这些荧光基团标记在dNTP的磷酸基团上。

　　SMRT测序反应采用边合成边测序原理，在合成过程中，当游离dNTP足够靠近底部时被固定在ZMW底部的酶捕获，若dNTP与模板链成功配对，此时会被激发光照射发出荧光，并被信号采集器记录下来，合成完成后，荧光基团随着磷酸基团自然脱落，开启新一轮测序反应。

　　图4 SMRT测序反应原理示意图[2]

　　结果读取

　　不同荧光标记的dNTP结合在每个孔的单分子模板上时可激发出不同波长的荧光，根据荧光的波长与峰值可判断加入的dNTP种类。[3]另外，可通过检测两个相邻碱基之间的测序时间来实现碱基修饰（如甲基化等）的检测，即如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰间的距离增大。[4]

　　图5 SMRT测序反应结果读取示意图[2]

　　SMRT测序技术特点及应用平台

　　SMRT测序技术使用的DNA聚合酶具有很高的活性，可以实现长读长检测，通常可以读取10kb及以上。同时，测序速度很快，每秒约10个碱基，通量可达7GB/天。但由于单分子测序，反应中产生的每个错误都被记录下来，虽然可以通过多次重复测序进行一定程度的纠正，但相较于第二代测序技术的准确性，SMRT技术的准确性稍低，因此一定程度上限制了技术的进一步发展。[4]

　　基于SMRT测序技术，PacBio公司于2011年正式发布并商用第一款产品PacBio RS，2013年-2019年陆续发布PacBio RS Ⅱ、PacBio Sequel和PacBio Sequel II，实现SMRT芯片上的ZMW孔数从15万到100万再到800万的升级。

　　图6 测序仪[5]

　　SMRT测序反应原理视频

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　　参考文献

　　[1] "Pacific Biosciences Develops Transformative DNA Sequencing Technology" . Pacific Biosciences Technology Backgrounder. 2008.

　　[2]Anthony Rhoads,Kin Fai Au,PacBio Sequencing and Its Applications[J].Genomics Proteomics Bioinformatics 13 (2015) 278–289

　　[3]Eid J,Fehr A,Gray J,et al.Real-time DNA sequencing from sigle polymerase molecules[J].Science,2009,323:133-138

　　[4]李金明.高通量测序技术[M].北京:科学出版社,2018